流式細胞儀主要構造和工作原理

一. 流式細胞術概述

     流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）是七十年代發(fā)展起來的高科學技術,它集計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學于一體, 同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內DNA、RNA含量等,可對群體細胞在單細胞水平上進行分析, 在短時間內檢測分析大量細胞,并收集、儲存和處理數(shù)據(jù),進行多參數(shù)定量分析; 能夠分類收集（分選）某一亞群細胞,分選純度＞95%。在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應用。
國內使用的流式細胞儀主要由美國的兩個廠家生產:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司（簡稱B-D公司）。流式細胞儀主要有兩型:臨床型（又稱小型機、臺式機）和綜合型（又稱大型機、分析型）。BECKMAN-COULTER公司產品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D公司產品為FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型，除具備檢測分析功能外,還具有細胞分選功能,多用于科學研究。

二.流式細胞儀主要技術指標

1．流式細胞儀的分析速度：
一般流式細胞儀每秒檢測1000～ 5000個細胞,大型機可達每秒上萬個細胞。
2．流式細胞儀的熒光檢測靈敏度：一般能測出單個細胞上<600個熒光分子,兩個細胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分。
3．前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：前向角散射（FSC）反映被測細胞的大小,一般流式細胞儀能夠測量到0.2μm～０.5μm。
4．流式細胞儀的分辨率：通常用變異系數(shù)CV值來表示，,一般流式細胞儀能夠達到<2.0%,這也是測量標本前用熒光微球調整儀器時要求必須達到的。
   5．流式細胞儀的分選速度：一般流式細胞儀分選速度＞1000個/秒，分選細胞純度可達99%以上。

三.流式細胞儀主要構造和工作原理    流動室及液流驅動系統(tǒng)

流式細胞儀主要由以下五部分構成:①流動室及液流驅動系統(tǒng)②激光光源及光束形成系統(tǒng)③光學系統(tǒng)④信號檢測與存儲、顯示、分析系統(tǒng)⑤細胞分選系統(tǒng)。
流動室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式細胞儀的核心部件，流動室由石英玻璃制成，單細胞懸液在細胞流動室里被鞘流液包繞通過流動室內的一定孔徑的孔,檢測區(qū)在該孔的中心，細胞在此與激光垂直相交，在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)。流動室里的鞘液流是一種穩(wěn)定流動，控制鞘液流的裝置是在流體力學理論的指導下由一系列壓力系統(tǒng)、壓力感受器組成，只要調整好鞘液壓力和標本管壓力, 鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向，能夠保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而使激光激發(fā)的熒光信息準確無誤。見圖12.1流動室示意圖。流動室孔徑有60μm、100μm、150μm 、250μm等多種，供研究者選擇。小型儀器一般固定裝置了一定孔徑的流動室。
圖12.1流動室示意圖（采自Coulter Training Guide）

 激光光源及光束形成系統(tǒng)

    流式細胞儀可配備一根或多根激光管，常用的激光管是氬離子氣體激光管，它的發(fā)射光波長488ηm,此外可配備氦氖離子氣體激光管（波長633ηm）和/或紫外激光管。

流式細胞儀的主要測定信號熒光是由激發(fā)光激發(fā)的，熒光信號的強弱與激發(fā)光的強度和照射時間相關，激光是一種相干光源,它能提供單波長、高強度、高穩(wěn)定性的光照，正是能達到這一要求的理想的激發(fā)光光源。
    在激光光源和流動室之間有兩個圓柱形透鏡，將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束（22μm×66μm），在這種橢圓形激光光斑內激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致。

光學系統(tǒng)

流式細胞儀的光學系統(tǒng)由若干組透鏡、小孔、濾光片組成，大致可分為流動室前和流動室后兩組。流動室前的光學系統(tǒng)由透鏡和小孔組成，透鏡和小孔（一般為2片透鏡、1個小孔）的主要作用是將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束，使激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致，zui大限度的減少雜散光的干擾；流動室后的光學系統(tǒng)主要由多組濾光片組成，濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管。濾光片主要有三類：長通濾片（LP）--只允許特定波長以上的光線通過，短通濾片（SP）-- 只允許特定波長以下的光線通過，帶通濾片（BP）-- 只允許特定波長的光線通過，不同組合的濾片可以將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管（PMT）,如接收綠色熒光（FITC）的PMT前面配置的濾光片是LP550和BP525, 接收色橙紅色熒光（PE）的PMT前面配置的濾光片是LP600和BP575, 接收紅色熒光（CY5）的PMT前面配置的濾光片是LP650和BP675。見圖12.2光學系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)示意圖。

信號檢測系統(tǒng)

    當測定標本在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)時產生散射光和熒光信號,散射光分為前向角散射（Forward Scatter, FS）和側向角散射或900散射（Side Scatter, SS）,散射光是細胞的物理參數(shù)與細胞樣本的制備（如染色）無關;熒光信號也有兩種,一種是細胞自發(fā)熒光它一般很微弱,一種是細胞樣本經標有特異熒光素的單克隆抗體染色后經激光激發(fā)發(fā)出的熒光，它是我們要測定的熒光,熒光信號較強,這兩種熒光信號的同時存在是我們測定時需要設定陰性對照的理由,以便從測出的熒光信號中減去細胞自發(fā)熒光和抗體非特異結合產生的熒光。

前向角散射（FS）反映被測細胞的大小,它由正對著流動室的光電二極管裝置接收并轉變?yōu)殡娦盘枺粋认蚪巧⑸浠?00散射（SS）反映被測細胞的細胞膜、細胞質、核膜的折射率和細胞內顆粒的性狀, 它由一個光電倍增管（PMT） 接收并轉變?yōu)殡娦盘?這些電信號存儲在流式細胞儀的計算機硬盤或軟盤內。

流式細胞儀測定常用的熒光染料有多種,他們分子結構不同,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異,選擇熒光染料時必須依據(jù)流式細胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長（如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波488ηm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長633ηm）。488ηm激光光源常用的熒光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP（葉綠素蛋白）、ECD（藻紅蛋白-得克薩斯紅）等。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是：
             激發(fā)光波長（ηm）       發(fā)射光峰值（ηm）
FITC            488                      525（綠）
PE              488                      575（橙紅）  
PI              488                      630（橙紅）
ECD             488                      610（紅）
CY5             488                      675（深紅）
PreCP           488                      675（深紅）
    各種熒光信號由各自的光電倍增管（PMT） 接收并轉變?yōu)殡娦盘柡蟠鎯υ诹魇郊毎麅x的計算機硬盤或軟盤內.見圖12.2光學系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)示意圖。

信號存儲、顯示、分析系統(tǒng)

（一） 信號存儲
存儲在流式細胞儀的計算機硬盤或軟盤內的數(shù)據(jù)一般是以List mode（列表排隊）方式存入的,采用List mode方式有兩大優(yōu)點:①節(jié)約內存和磁盤空間②易于加工處理分析。
（二）信號顯示和分析
由于List mode方式數(shù)據(jù)缺乏直觀性，數(shù)據(jù)的顯示和分析一般采用一維直
方圖（圖12.3）、二維點陣圖（圖12.4,12.5）、等高線圖（圖12.8）和密度圖（圖12.7）。
     1．單參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細胞的每一個單參數(shù)測量數(shù)據(jù)用直方圖來顯 示，圖中橫坐標表示散射光或熒光信號相對強度值，其單位是道數(shù)，可以是線性的，也可以是對數(shù)的；縱坐標表示細胞數(shù)。見圖12.3一維直方圖，圖中橫坐標是FITC熒光信號相對強度值（對數(shù)），縱坐標表示細胞數(shù);圖中已根據(jù)陰性對照設定適當?shù)?ldquo;門”（直線門），儀器的計算機就會給出測定值（包括陽性細胞%和平均熒光強度）。

2.雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細胞的雙參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細胞數(shù)量的關系用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。如圖12.4二維點陣圖，是正常人外周血白細胞的前向散射光（FS）和側向散射光（SS）組成的點陣圖，橫坐標和縱坐標均是線性的，圖中淋巴細胞、單核細胞、粒細胞很明顯地分為3群，可以很容易地圈“門”（ Bitmap，無定型門），分析各亞群細胞的數(shù)據(jù);圖12.6假三維地形圖（X軸: SSC ,Y軸:FSC Z軸:細胞數(shù)）更清楚地表明這一點。圖12.5二維點陣圖是細胞的兩種熒光（FITC和RD1）雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示，橫坐標和縱坐標均是對數(shù)的，橫坐標代表FITC，縱坐標代表PE，圖中已設定適當?shù)?ldquo;門”（十字門），十字門的D1、D2、D3、D4門分別代表PE單陽性細胞、PE和FITC雙陽性細胞 、陰性細胞、FITC單陽性細胞。儀器的計算機就會給出兩種熒光測定值（包括陰性細胞%、兩種熒光各自的陽性細胞%、兩種熒光的雙陽性細胞%、各群細胞的平均熒光強度）。 圖12.7和圖12.8分別是測定細胞的兩種熒光雙參數(shù)數(shù)據(jù)的密度圖和等高線圖，橫坐標和縱坐標分別代表一種熒光參數(shù)，同理只要設定十字門就可得到兩種熒光的各種測定值，密度圖和等高線圖較點陣圖更直觀。
   3．三參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細胞的三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細胞數(shù)量的關系每兩個數(shù)據(jù)組成一對（三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細胞數(shù)量每兩個數(shù)據(jù)可組成6對數(shù)據(jù)）用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。三個熒光數(shù)據(jù)關系用分光圖（prism）表示，分光圖可直接給出8個數(shù)據(jù)（如用ABC代表3種熒光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。見圖12.9 prism，圖12.9為人外周血淋巴細胞亞群測定結果的分光圖，圖中給出CD3、CD4、CD8組合的各種結果，如T輔助細胞（CD3+CD4+CD8-）為42.0%,如T抑制細胞（CD3+CD4+CD8-）為17.4%。

圖12.5兩種熒光的二維點陣圖（采自Coulter Operaters Guide） 
   圖12.7. 雙參數(shù)數(shù)據(jù)的密度圖（采自Coulter Operaters Guide）      
   圖12.6假三維地形圖和二維點陣圖（采自Coulter Operaters Guide）
   圖12.8雙參數(shù)數(shù)據(jù)的等高線圖（采自Coulter Operaters Guide）
   圖12.9 分光圖（prism）

細胞分選系統(tǒng)

 如在細胞流動室上裝有超聲壓電晶體,通電后超聲壓電晶體發(fā)生高頻震動，可帶動細胞流動室高頻震動,使細胞流動室噴咀流出的液流束斷成一連串均勻的液滴, 每秒鐘形成液滴上萬個。每個液滴中包含著一個樣品細胞,液滴中的細胞在形成液滴前已被測量,如符合預定要求則可被充電,在通過偏轉板的高壓靜電場時向左或向右偏轉被收集在容器中,不含細胞液滴或細胞不符合預定要求液滴不被充電亦不發(fā)生偏轉進入中間廢液收集器中,從而實現(xiàn)了分選。分選的詳細原理和操作請有興趣者參考有關文獻。